十二月份环状RNA研究汇总

声  明

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        新年之际，山人祝大家新年快乐！

        在过去的12月份里，环状RNA取得了不少的进展，包括circPVT1的分子机制，人类睾丸来源的精液血浆中环状RNA鉴定，环状RNA进化特征分析，全新的环状RNA分析工具acfs等，12月份是环状RNA研究的丰收月，下面就让我们一起回顾一下这些主要研究论文吧：

1  环状RNA circPVT1分子机制研究新进展
        仅在12月份一个月时间里，关于circPVT1的机制研究论文就有两篇，这在环状RNA研究报道中比较少见，说明该环状RNA受到了科学家们的高度关注。

        第一篇文章是介绍发现circPVT1具有抑制细胞衰老的作用。12月7日，Nucleic Acids Research杂志在线发表了NIH遗传与基因组学实验室Amaresh C. Panda和Ioannis Grammatikakis为通讯作者的文章，介绍发现circ-PVT1具有抗衰老的作用(Panda et al., 2016)。

        文中通过分析培养代数早的和晚的细胞中环状RNA的变化情况，发现circ-PVT1在衰老的细胞中明显下降。基于预测和实验验证，作者证实circ-PVT1可以竞争性结合let-7，抑制let-7调控的下游基因，包括IGF2BP1, KRAS和HMGA2最终抑制衰老进程。文中用到了生物素标记法进行RNA Pull-down的技术方法分析相互作用的miRNA分子，RIP鉴定相互作用蛋白，微滴式数字PCR进行绝对定量，这些技术方法都值得学习借鉴。

图1 circ-PVT1可以竞争性结合let-7抑制衰老信号（来自(Panda et al., 2016)）

        第二篇是复旦大学黄胜林教授发现的circPVT1与胃癌增殖和预后的关系(Chen et al., 2016)，文章在线发表在12月13日的Cancer Lettres杂志上，黄胜林教授和师英强主任为共同通讯作者。

        作者选取了三个胃癌标本和对应的癌旁组织进行RNA Seq检测。最终发现circPVT1在胃癌组织中表达差异最明显。随后作者通过预测分析和实验验证表明circPVT1可竞争性结合miR-125家族及let-7，作者主要分析了circPVT1竞争性结合miR-125家族的作用对细胞增殖等指标的影响，最终表明circPVT1可促进胃癌细胞增殖。circPVT1表达量与胃癌临床表现的关系研究表明circPVT1高表达的患者生存率更高。circPVT1作为预后指标，可独立于肿瘤大小，TNM分期等指标，并且TNM分期结合circPVT1表达量一起作为预后分析的指标更有价值。

图2 circPVT1结合PVT1的表达量是更好的胃癌预后指标（来自(Chen et al., 2016)）

2  人类睾丸来源的精液血浆中发现大量全新的环状RNA
        12月13日，Scientific Reports在线发表了华中科技大学同济医学院李红刚为通讯作者的文章，介绍在人类精液中发现大量环状RNA(Dong et al., 2016b)。 

        作者共鉴定到一万五千多种环状RNA，其中10792种为首次发现和报道的，这些新发现的环状RNA对应的基因主要参与精子发生，精子运动和受精作用。这项工作开辟了新的环状RNA研究方向，也为无创诊断提供了新的探索方向。本文的研究数据也极大丰富了环状RNA的种类信息，是环状RNA研究的宝贵资源。

图3 1017种全新的环状RNA主要特征分析（来自(Dong et al., 2016b)）

3  环状RNA种类多样性伴随进化增高
        12月16日，RNA Biology杂志在线发表了陈玲玲教授和杨力教授共同通讯作者的研究论文，介绍基于生物信息学的分析发现环状RNA的种类多样性会伴随着物种进化程度而增多，绝大部分的环状RNA的形成过程均由短散在核重复序列（SINE）驱动，该研究也暗示SINE元件的在进化中的重要性(Dong et al., 2016a)。

        在人和小鼠的研究数据中，环状RNA的表达状态存在组织和疾病特异性的特征，更有趣的是人和小鼠中已知的环状RNA重合的非常少，那么造成这种现象的原因是什么呢？本文作者利用信息学技术深入探索了这个问题。本文借助互补指数（Complementary Sequence Index，CSI）进行定量化分析反向互补元件的互补配对能力，分析了与环状RNA形成有关的短散在核重复序列（short interspersed nuclear repetitive DNA elements, SINE）的进化特征，发现伴随着进化进程，SINE的数目明显增多，互补配对的能力也逐渐提高，与此对应的是环状RNA的种类和表达量均有提高。暗示了反向互补的SINE元件可能是驱动环状RNA形成的决定性因素，这为进一步认识环状RNA的进化机制提供了重要的参考。

图4 互补指数（CSI）计算原理 （来自(Dong et al., 2016a)）

4  环状RNA数据分析新工具
        12月8日，Scientific Reports杂志在线发表了柏林Zuse学院You Xintian为通讯作者的文章，介绍开发了一个全新的环状RNA  de novo分析的算法工具(You and Conrad, 2016)。

        环状RNA越来越受到学术界的重视，但目前主流的环状RNA分析算法和工具仍存在一些问题，作者详细分析后汇总为五个主要的问题：（1）反向拼接位点的分析应基于全基因组序列的无偏差（unbiased manner）分析，但一些算法工具的分析则是基于目前的外显子位置注释，比如CIRCexplorer、KNIFE和MapSplice2。基于已注释的外显子位置信息当然可以大大缩小分析的范围，但这可能会损失一些携带了未注释的全新外显子的环状RNA，例如circSRY2 和 circCDR1as都不能用现有的外显子注释进行分析。（2）反向拼接位点的分析准确性需要审查验证。常用的环状RNA分析工具如CIRCexplorer、circRNA_Finder、CIRI28、及find_circ报告分析得到的反向拼接位点往往基于经典的RNA拼接规则，比如“GU-AG”规则。这样势必会排除一些非经典拼接的产物。RNA拼接的决定因素也不仅仅在四个碱基，还有更长的序列条件。RNA拼接是一个复杂的过程，因此环状RNA的分析显然需要更准确有效的算法。（3）受测序Reads mapping算法的影响，无法做到对反向拼接所对应的环状RNA的精确定量，重新对所预测的反向拼接位点进行再分析可以帮助提高定量的准确度。（4）一些常用的环状RNA分析算法工具只适合双端（paired-end，PE）测序结果，也限制了环状RNA分析的有效性。（5）目前还没有专门针对由于基因融合而形成的环状RNA的分析工具。基于上述五个原因，作者开发了acfs（accurate circRNA finder suite）工具。

图5 acfs算法主要流程（来自(You and Conrad, 2016)）

5  老年小鼠大脑中环状RNA富集

        12月13日，Scientific Reports在线发表了内华达大学Pedro Miura教授团队的一项研究成果，介绍发现环状RNA在老龄化的小鼠大脑中富集，而所对应的心脏中没有发现明显的富集效应，这些环状RNA所对应的线性RNA分子变化也不明显，说明环状RNA的富集行为是不依赖所对应的线性RNA的(Gruner et al., 2016)。

        作者分析了1月龄和22月龄小鼠的不同组织中环状RNA的总体表达情况，发现大脑中环状RNA呈现随着衰老而增多的趋势。挑选了有代表性的环状RNA进行了QPCR验证。然后对这些环状RNA进行了通路分析。还比较了它们所对应的线性RNA的表达情况，最后发现老龄化小鼠大脑中的环状RNA有较明显的增多但所对应的线性RNA差别不明显。

图6 小鼠大脑随衰老而增多的环状RNA对应的通路（来自(Gruner et al., 2016)）

6  疾病相关环状RNA的研究报道
        疾病相关环状RNA的鉴定分析一直是环状RNA研究的热点方向之一，12月份有两篇。具体整理如下：

        12月19日，Cellular Physiology and Biochemistry杂志在线发表了西京医院Li Haimin等的一项研究工作，介绍基于芯片法分析了胰腺导管腺癌中环状RNA的表达情况(Li et al., 2016)。相对于癌旁组织，在胰腺导管腺癌中共发现了209种环状RNA上调，142种下调。

        12月9日，OncoTargets and Therapy在线发表了南京医科大学何敬东教授为通讯作者的文章，介绍发现环状RNA hsa_circ_0000069与结肠癌细胞增殖，迁移，浸润有关(Guo et al., 2016)。

7  AD病人ciRS-7缺失导致泛素连接酶UBE2A缺失
        12月5日，Genes杂志发表了路易斯安那州立大学健康科学中心Walter J. Lukiw教授团队的一项研究研究成果，介绍发现AD病人ciRS-7缺失导致miR-7活性不受调控，并最终导致泛素连接酶UBE2A的缺失(Zhao et al., 2016)。

        文中用到了一种称为LED-Northern的RNA杂交技术，该技术是利用合成的LNA探针借助EDAC交联到尼龙膜上，再利用DIG标记的探针进行斑点杂交的一种技术。

图7 AD病人中ciRS-7缺失导致UBE2A 缺失 （来自(Zhao et al., 2016)）

8  环状RNA研究进展综述：
        12月份有多篇综述文章汇总分析了环状RNA的研究进展。

        12月16日，丹麦奥胡斯大学Karoline K. Ebbesen联合著名环状RNA专家Jørgen Kjems在RNA Biology杂志在线发表了一篇综述文章，汇总分析了环状RNA研究的现状(Ebbesen et al., 2016)。这篇文章分别介绍了环状RNA的基本特征，细胞内表达量及进化保守性特征。重点介绍了环状RNA形成机制方面的进展，包括剪切体与环状RNA形成的关系，反向互补序列，RNA结合蛋白，RNA拼接机器对形成环状RNA的作用，还讨论了环状RNA形成过程是同步还是晚于线性RNA的转录的问题。环状RNA功能方面，主要讨论了作为miRNA Sponge，蛋白Sponge，转录调控机制及可能翻译多肽的机制。在文章的最后作者提出了环状RNA出核和降解的问题是环状RNA仍没有解释清楚的重要问题。

        12月23日，Yale Journal Of Biology And Medicine在线发表了内华达大学Pedro Miura教授为通讯作者的综述文章，汇总分析了环状RNA功能的主要研究进展(Cortes-Lopez and Miura, 2016)。文中介绍了环状RNA检测分析技术，表达丰度调控机制进展，主要功能模型等。

        12月1日，Clinical Chemistry and Laboratory Medicine发表了江苏大学附属医院Wenrong Xu 和Xu Zhang为通讯作者的综述文章，汇总分析了外泌体中非编码RNA作为肿瘤标志物的可行性。其中也提到了外泌体中环状RNA作为肿瘤标志物的(Yang et al., 2016)可行性，提到了circ-KLDHC10在结肠癌中作为标志物的可行性。

        12月20日，Springer出版的 Handbook of Experimental Pharmacology中一个章节介绍了非编码RNA与心脏衰竭的关系，其中提到了环状RNA。这一章节的通讯作者是汉诺威医学院的Thomas Thum(Dangwal et al., 2016)。

参考文献：

1. Chen, J., Li, Y., Zheng, Q., Bao, C., He, J., Chen, B., Lyu, D., Zheng, B., Xu, Y., Long, Z., et al. (2016). Circular RNA profile identifies circPVT1 as a proliferative factor and prognostic marker in gastric cancer. Cancer Lett.

2. Cortes-Lopez, M., and Miura, P. (2016). Emerging Functions of Circular RNAs. The Yale journal of biology and medicine 89, 527-537.

3. Dangwal, S., Schimmel, K., Foinquinos, A., Xiao, K., and Thum, T. (2016). Noncoding RNAs in Heart Failure. Handbook of experimental pharmacology.

4. Dong, R., Ma, X.K., Chen, L.L., and Yang, L. (2016a). Increased complexity of circRNA expression during species evolution. RNA biology, 0.

5. Dong, W.W., Li, H.M., Qing, X.R., Huang, D.H., and Li, H.G. (2016b). Identification and characterization of human testis derived circular RNAs and their existence in seminal plasma. Sci Rep 6, 39080.

6. Ebbesen, K.K., Hansen, T.B., and Kjems, J. (2016). Insights into circular RNA biology. RNA biology, 0.

7. Gruner, H., Cortes-Lopez, M., Cooper, D.A., Bauer, M., and Miura, P. (2016). CircRNA accumulation in the aging mouse brain. Sci Rep 6, 38907.

8. Guo, J.N., Li, J., Zhu, C.L., Feng, W.T., Shao, J.X., Wan, L., Huang, M.D., and He, J.D. (2016). Comprehensive profile of differentially expressed circular RNAs reveals that hsa_circ_0000069 is upregulated and promotes cell proliferation, migration, and invasion in colorectal cancer. OncoTargets and therapy 9, 7451-7458.

9. Li, H., Hao, X., Wang, H., Liu, Z., He, Y., Pu, M., Zhang, H., Yu, H., Duan, J., and Qu, S. (2016). Circular RNA Expression Profile of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Revealed by Microarray. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology 40, 1334-1344.

10. Panda, A.C., Grammatikakis, I., Kim, K.M., De, S., Martindale, J.L., Munk, R., Yang, X., Abdelmohsen, K., and Gorospe, M. (2016). Identification of senescence-associated circular RNAs (SAC-RNAs) reveals senescence suppressor CircPVT1. Nucleic Acids Res.

11. Yang, H., Fu, H., Xu, W., and Zhang, X. (2016). Exosomal non-coding RNAs: a promising cancer biomarker. Clinical chemistry and laboratory medicine 54, 1871-1879.

12. You, X., and Conrad, T.O. (2016). Acfs: accurate circRNA identification and quantification from RNA-Seq data. Sci Rep 6, 38820.

13. Zhao, Y., Alexandrov, P.N., Jaber, V., and Lukiw, W.J. (2016). Deficiency in the Ubiquitin Conjugating Enzyme UBE2A in Alzheimer's Disease (AD) is Linked to Deficits in a Natural Circular miRNA-7 Sponge (circRNA; ciRS-7). Genes 7.

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